目錄
目錄 I
摘要 III
Abstract V
第一章 文獻綜述 - 1 -
1.1 表皮生長因子及其家族 - 1 -
1.1.1表皮生長因子理化性質(zhì) - 1 -
1.1.2 EGF的生理功能及應用 - 3 -
1.1.3 EGF生理功能的作用機制 - 4 -
1.1.4 EGF家族成員及其結構與功能特性 - 7 -
1.2 EGF受體（EGFR）的生理特性及其研究進展 - 7 -
1.2.1 EGFR的生理特性及信號傳導途徑 - 7 -
1.2.2 EGFR在癌癥發(fā)生、發(fā)展及治療中作用的研究現(xiàn)狀 - 9 -
1.3 本研究的方法與技術 - 12 -
1.3.1 本研究的技術路線 - 12 -
1.3.2 定向進化技術及本研究采用的改組策略 - 12 -
1.3.3 噬菌體展示高通量篩選技術 - 16 -
1.3.4 圓二色譜技術在生物學領域的應用 - 18 -
第二章 EGF定向突變文庫的構建 - 22 -
2.1 材料與方法 - 22 -
2.1.1 實驗材料 - 22 -
2.1.2 方法 - 24 -
2.2 結果與分析 - 28 -
2.2.1 易錯PCR誘變hEGF與pEGF - 28 -
2.2.2 StEP重組文庫的建立 - 30 -
2.3 討論 - 31 -
2.3.1 進化親本的選擇 - 31 -
2.3.2 易錯PCR條件的優(yōu)化 - 32 -
2.3.3 StEP條件的選擇 - 33 -
2.4 小結 - 34 -
第三章 突變文庫的親和性篩選及陽性克隆的表達、純化及活性檢測 - 35 -
3.1 材料與方法 - 35 -
3.1.1實驗材料 - 35 -
3.1.2 方法 - 38 -
3.2 結果與分析 - 43 -
3.2.1 噬菌體表面展示文庫的建立 - 43 -
3.2.2 噬菌體展示文庫的淘洗篩選 - 44 -
3.2.2 細胞ELISA篩選淘洗后文庫 - 44 -
3.3 討論 - 45 -
3.3.1 細胞表面噬菌體展示文庫的篩選 - 45 -
3.3.2 ELISA方法的選擇 - 47 -
3.4 小結 - 48 -
第四章 噬菌體展示陽性克隆的表達與活性檢測 - 49 -
4.1 材料與方法 - 49 -
4.1.1實驗材料 - 49 -
4.1.2 方法 - 51 -
4.2 結果與分析 - 56 -
4.2.1 陽性克隆表達載體的構建 - 56 -
4.2.2 重組EGF的表達及純化 - 57 -
4.2.3 MTT分析重組蛋白活性 - 58 -
4.2.4 重組子序列的測定分析 - 58 -
4.2.5 EGF E40V表達條件的優(yōu)化 - 59 -
4.2.6 優(yōu)化條件下的表達規(guī)模擴增 - 60 -
4.2.7 純化蛋白的透析與蛋白濃度的測定 - 63 -
4.3 討論 - 64 -
4.3.1 大腸桿菌融合性表達重組EGF - 64 -
4.3.2 原核表達蛋白的純化 - 66 -
4.3.3 MTT實驗條件的調(diào)整 - 68 -
4.3.4 重組EGF序列突變位點的分析 - 69 -
4.4 小結 - 69 -
第五章 EGF Y13G突變體的獲得、EGF的pET28a重組表達與樣品的圓二色譜分析 - 71 -
5.1 材料與方法 - 71 -
5.1.1 材料 - 71 -
5.1.2 方法 - 72 -
5.2 結果與分析 - 75 -
5.2.1 pET28a-EGF重組表達條件的優(yōu)化 - 75 -
5.2.2 純化蛋白樣品的圓二色譜測定分析 - 78 -
5.3 討論 - 79 -
5.3.1 pET28a重組表達EGF - 79 -
5.3.2 圓二色譜檢測EGF二級結構 - 80 -
5.4 小結 - 81 -
第六章 總結與展望 - 82 -
6.1 總結 - 82 -
6.2 展望 - 82 -
縮略詞表 - 84 -
參考文獻 - 86 -
致 謝 - 93 -




表皮生長因子體外定向進化及對其結構與功能之間關系的研究

生物化學與分子生物學

摘要

人表皮生長因子(human epidermal growth factor，hEGF)發(fā)現(xiàn)于1962 年，是一種由53 個氨基酸殘基組成的單體多肽。已證實hEGF 是一種關鍵性的創(chuàng)傷愈合因子，通過與其受體的結合，它能對上皮細胞和間質(zhì)細胞產(chǎn)生很強的致分裂作用；能促進皮膚、角膜、肺和氣管上皮組織等的增殖和分化；對表皮損傷和潰瘍具有卓越修復功能；臨床上對腸、胃、肝等器官表面損傷的修復和再生也有顯著療效?？傊琱EGF在醫(yī)療、美容護膚等方面有著廣泛的應用前景。
但是由于其自身半衰期較短等不利因素，至今尚未得到廣泛的使用，利用分子手段將它進行改造已成為必然。針對EGF的三維結構已比較清楚但結構和功能之間的關系并不清楚而且EGF分子本身很小不利于改組的情況，本研究采用易錯PCR和StEP聯(lián)合的方法將hEGF和pEGF的DNA進行分子定向進化。通過多次嘗試，探索了簡便、有效、優(yōu)化的EGF體外定向進化的技術路線，構建了定向進化文庫，用SSCP初步檢測文庫突變率可以達到其它大分子改組的水平。然后將突變文庫構建成噬菌體展示文庫，通過活細胞噬菌體展示、ELISA和MTT的方法篩選到活性增強的突變體EGF26，為EGF體外定向進化提供可借鑒經(jīng)驗。通過測序我們發(fā)現(xiàn)了其突變?yōu)?0Glu→Val，為了解這一突變引起的二級結構變化，對EGF26和hEGF進行了圓二色譜的檢測，并分析了這些變化對EGF活性增強的貢獻，為了解EGF結構與功能之間聯(lián)系打開新的視角。
此外，本研究構建了pET32a(+)-EGF26 重組質(zhì)粒，以本實驗室構建保存的pET32a(+)-hEGF為對照，用BL21為宿主菌進行融合表達。通過表達條件的優(yōu)化最終確定在37℃，菌液初始OD600=0.5，IPTG 0.5mmol/L，誘導時間6 小時的條件下EGF得到最高的溶解性表達，而且使用金屬螯合親和層析純化后結果表明，EGF26的溶解性表達優(yōu)于hEGF，為EGF26的最終應用打下基礎。

關鍵詞：表皮生長因子 定向進化 噬菌體展示 CD譜 溶解性表達 二級結構